Pracownia Glikobiologii Grzybów

Kierownik zakładu: prof. dr hab. Grażyna Palamarczyk


Tematyka pracowni koncentruje się na badaniach dotyczących biosyntezy i regulacji glikozylacji białek w komórkach drożdży S.cerevisiae i C.albicans oraz w grzybie nitkowatym Trichoderma reesei. Prace na drożdżach (prowadzone przez G. Palamarczyk) dotyczą głównie badania roli glikozylacji białek w patogenezie oraz wrażliwości na leki przeciwgrzybicze. Metaboliczne inżynierowanie komórek Trichoderma (prowadzone przez J. Kruszewską) ma na celu podniesienie walorów biotechnologicznych tego organizmu.
    

Molekularne mechanizmy glikozylacji białek w drożdżach Saccharomyces cerevisiae i Candida albicans

Kierownik Zespołu: prof. dr hab. Grażyna Palamarczyk
Zespół: dr Anna Janik, mgr Monika Pasikowska (doktorantka), mgr Mateusz Juchimiuk (doktorant)
 
Tematyka dotyczy badań podstawowych nad regulacją glikozylacji białek ściany komórkowej oraz znaczeniem tego procesu dla integralności komórki drożdżowej. Ta dziedzina jest ciągle mało poznana w drożdżach S. cerevisiae a zwłaszcza w patogenie drożdżowym jakim jest C. albicans.
Komórki eukariotyczne syntetyzują N-glikany, związane z resztą amidową asparaginy, w reakcji wielostopniowej, w której kluczową rolę odgrywa oligosacharyd związany z izoprenoidowym lipidem, fosforanem  dolicholu. Fosforan dolicholu bierze również udział w reakcjach O-mannozylacji, odgrywających istotną rolę w utrzymaniu  integralności komórki.
Jak wykazaliśmy(Orłowski et al.2007), komórki drożdży zaburzone w syntezie fosforanu dolicholu i dolichylofosfomannozy charakteryzują się zmianami w strukturze i składzie chemicznym ściany komórkowej a także zmienioną wrażliwością na niektóre leki przeciwgrzybicze.
Obecnie zajmujemy się charakterystyką kluczowych reakcji w biosyntezie dolicholu oraz jego glikozylacji w drożdżach C. albicans. Celem tych badań jest poszukiwanie reakcji mających wpływ na powstawanie form wirulentnych oraz decydujących o wrażliwości na leki przeciwgrzybicze. W tym kierunku sklonowaliśmy geny zaangażowane w biosyntezę dolicholu i jego fosforylację (CaRER2 i CaSEC59) i wykazaliśmy, że ich supresja jest istotna dla powstawania formy wirulentnej (strzępkowej) C. albicans.
Następnym krokiem będzie konstrukcja mutantów zaburzonych w dolicholo-zależnych etapach glikozylacji białek oraz zbadanie ich zdolności do tworzenia form wirulentnych i wrażliwości na leki przeciwgrzybicze.
   
Projekty badawcze:
2005-2008Organizacja ściany komórkowej S. cerevisiae i Candida albicans a wrażliwość na leki przeciwgrzybicze (Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego)
2004-2005Euro Cell Wall - Fungal cell wall as a target for antimicrobial therap (EU FP5)
Wybrane publikacje:
  1. Kuranda K., François J., Palamarczyk G. The isoprenoid pathway and transcriptional response to its inhibitors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. (2009) - Epub ahead of print
  2.  Kuranda K., Grabinska K., Berges T., Karst F., Leberre V., Sokol S., François J., Palamarczyk G. The YTA7 gene is involved in the regulation of the isoprenoid pathway in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. (2009) 9(3): 381-90
  3. Orłowski J., Machula K., Janik A., Zdebska E., Palamarczyk G. Dissecting the role of dolichol in cell wall assembly in the yeast mutants impaired in early glycosylation reactions. Yeast (2007) 24(4): 239-52
  4. Kuranda K., Leberre V., Sokol S., Palamarczyk G., François J. Investigating the caffeine effects in the yeast Saccharomyces cerevisiae brings new insights into the connection between TOR, PKC and Ras/cAMP signalling pathways. Mol Microbiol. (2006) 61(5): 1147-66
  5. Grabińska K., Sosińska G., Orłowski J., Swiezewska E., Berges T., Karst F., Palamarczyk G. Functional relationships between the Saccharomyces cerevisiae cis-prenyltransferases required for dolichol biosynthesis. Acta Biochim. Pol. (2005) 52(1): 221-32
  6.  Kamińska J., Kwapisz M., Grabińska K., Orłowski J., Boguta M., Palamarczyk G., Zoładek T. Rsp5 ubiquitin ligase affects isoprenoid pathway and cell wall organization in S. cerevisiae. Acta Biochim Pol. (2005) 52(1): 207-20
  7. Grabińska K., Palamarczyk G. Dolichol biosynthesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae: an insight into the regulatory role of farnesyl diphosphate synthase. FEMS Yeast Res. (2002) 2(3): 259-65
  8. Janik A., Sosnowska M., Kruszewska J., Krotkiewski H., Lehle L., Palamarczyk G. Overexpression of GDP-mannose pyrophosphorylase in Saccharomyces cerevisiae corrects defects in dolichol-linked saccharide formation and protein glycosylation. Biochim. Biophys. Acta. (2003) 1621(1): 22-30

Genetyczne modyfikacje grzybów o znaczeniu biotechnologicznym i biokontrolnym
 
Kierownik Zespołu: prof. dr hab. Joanna S. Kruszewska
Zespół: dr Urszula Perlińska-Lenart, dr Wioletta Górka-Nieć, mgr inż. Patrycja Zembek, mgr Sebastian Graczyk

Trichoderma jest grzybem nitkowatym, który wydziela do środowiska duże ilości enzymów hydrolitycznych. Grzyb ten jest używany w biotechnologii do produkcji białek własnych i białek obcych a także jest stosowany w rolnictwie jako biofungicyd. Zarówno biotechnologia jak i biokontrola wykorzystuje niezwykłe właściwości wydzielnicze Trichoderma.
Prace przeprowadzone w naszym Zespole uwidoczniły ścisły związek między aktywnością procesu O-glikozylacji uTrichoderma a produkcją i sekrecją białek. Nadekspresja drożdżowego genu DPM1 kodującego kluczowy enzym procesu O-glikozylacji w T.reesei spowodowała aktywację procesu O-glikozylacji i wielokrotne podwyższenie sekrecji białek. Zanotowano również spektakularne zmiany morfologiczne dotyczące głównie ściany komórkowej. Charakterystyka transformantów ujawniła zmiany w składzie cukrowym ściany komórkowej takie jak obniżenie poziomu mannozy i beta-(1, 6) glukanu oraz podwyższenie poziomu chityny. Stwierdzono również, że mimo zmian w składzie i morfologii ściana stanowi nadal barierę dla sekrecji białek. Wykazano bowiem, że usunięcie ściany komórkowej zwiększa wielokrotnie sekrecję.
Zebrane wyniki dotyczące powiązania produkcji i modyfikacji potranslacyjnych białek z ich sekrecją dały podstawy do opracowania odpowiednich modyfikacji genetycznych grzybów w kierunku zwiększenia aktywności i wydzielania enzymów hydrolitycznych korzystnych w biotechnologii i biokontroli. 
Nasz Zespół zajął się również klonowaniem i analizą funkcjonalną genów Trichoderma kodujących enzymy szlaku O-glikozylacji. Sklonowano geny dpm2 i dpm3 kodujące podjednostki syntazy DPM i dokonano ich analizy funkcjonalnej w S.cerevisiae. Dokonano również analizy funkcjonalnej genu pmt1 kodującego O-mannozylotransferazę I poprzez ekspresję w S.cerevisiae oraz dysrupcję w T.reesei. Trwają również prace nad klonowaniem i analizą genów O-mannozylotransferaz pmt2 i pmt3, oraz genów erg 20 oraz rer2.
    
Projekty badawcze:
2009-2012Inżynierowanie szczepów Trichoderma o wzmocnionych właściwościach biokontrolnych (Fundusz Strukturalny, POIG, Ośrodek Przetwarzania Informacji)
2006-2009Optymalizacja właściwości biokontrolnych grzybów z rodzaju Trichoderma (Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego)
2005-2008Genomika funkcjonalna modelowych mikroorganizmów w badaniach molekularnych podłoża ludzkich chorób genetycznych i patogenności (Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego)
Wybrane publikacje:
  1. Górka-Nieć W., Pniewski M., Kania A., Perlińska-Lenart U., Palamarczyk G., Kruszewska J.S. Disruption of Trichoderma reesei gene encoding protein O-mannosyltransferase I results in a decrease of the enzyme activity and alteration of cell wall composition. Acta Biochim.Pol. (2008) 55: 251-260
  2. Kruszewska J.S., Perlińska-Lenart U., Górka-Nieć W., Orłowski J., Zembek P. Palamarczyk G. Alterations in protein secretion caused by metabolic engineering of glycosylation pathways in fungi. Acta Biochim.Pol. (2008) 55: 447-456
  3. Górka-Nieć W., Bańkowska R, Palamarczyk G., Krotkiewski H., Kruszewska J.S. Protein glycosylation in pmt mutants of Saccharomyces cerevisiae. Influence of heterologously expressed cellobiohydrolase II of Trichoderma reesei and elevated levels of GDP mannose and cis-prenyltransferase activity. Biochim. Biophys. Acta (2007) 1770: 774–780
  4. Perlinska-Lenart U., Bankowska R., Palamarczyk G., Kruszewska J.S. Overexpression of the Saccharomyces cerevisiae RER2 gene in Trichoderma reesei affects dolichol dependent enzymes and protein glycosylation. Fungal Genet. Biol. (2006) 43(6): 422-9
  5. Perlińska-Lenart U.,  Orłowski J., Laudy A.E., Zdebska E., Palamarczyk G., Kruszewska J.S Glycoprotein hypersecretion alters cell wall in Trichoderma reesei strains expressing the Saccharomyces cerevisiae dolichylphosphate mannose synthase gene. Appl. Environ. Microbiol. (2006) 72: 7778-7784
  6. Perlińska-Lenart U., Kurzątkowski W., Janas P., Kopińska A, Palamarczyk G., Kruszewska J.S Protein production and secretion in an Aspergillus nidulans mutant impaired in glycosylation. Acta Biochim. Pol. (2005) 52: 195-205