Zakład Biosyntezy Białka

Kierownik Zakładu: prof. dr hab. Andrzej Jerzmanowski

W ciągu ostatnich lat grupy badawcze Zakładu prowadziły prace poświęcone kilku podstawowym tematom dotyczącym struktury i funkcji patogenów o genomie RNA.
Badanie nad białkiem VpG wirusa PVY (Potato Virus Y, wirus ziemniaka Y) prowadzone są przez zespół Jadwigi Chroboczek i Włodzimierza Zagórskiego dotyczyły oddziaływania tego białka z faktorem inicjalizacji translacji eIF4E, oraz wpływu tego oddziaływania na proliferację komórek.
Zespół Anny Boguszewskiej-Chachulskiej do marca 2009 kontynuował badanie inhibitorów replikacji HCV (Hepatitis Virus C). Badania te są dziś prowadzone w laboratorium Anny Boguszewskiej–Chachulskiej na Politechnice Warszawskiej.
Badania nad rolą regulatorową wybranych sekwencji PLRV (Potato Leafroll Virus, wirus liściozwoju ziemniaka), prowadzone pod kierunkiem Andrzeja Pałuchy zostały zakończone na początku 2009, część członków zespołu dołączyła do innych grup instytutowych.
Jednym z ważnych zainteresowań w Zakładzie pozostaje genomika. Znajduje to swoje odbicie w udziale kilku grup instytutowych, z różnych Zakładów i Pracowni w międzynarodowym konsorcjum sekwencjonującym genom ziemniaka (Potato Genome Sequencing Consortium PGSC). Koordynatorem tego intra instytutowego programu jest W. Zagórski.
W październiku 2009 Konsorcjum przekazało do domeny publicznej pierwszy uporządkowany szkic pełnej sekwencji genomu ziemniaka.
W grupie Anny Góra-Sochackiej trwały badania nad mechanizmami patogenezy i infekcyjności PSTVd (Potato Spindle Tuber Viroid – wirus wrzecionowatości bulw ziemniaka).
Grupa Ewy Szołajskiej prowadziła badania nad dodekahedronami Adenowirusa, mogącymi służyć jako wektory leków antyproliferacyjnych i / lub antygenów wirusa grypy.
Nowym polem badawczym są prace nad czujnikami elektrochemicznymi mającymi wykrywać białka czynne biologicznie i oznaczać ich stany konformacyjne (zespół Krystyny Grzelak we współpracy z prof. Jerzym i Hanną Radeckimi, Instytut Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności, Olsztyn).
Zespoły Profesorów Andrzeja Jerzmanowskiego i Marty Prymakowskiej-Bosak badają mechanizmy rozwoju i pamięci epigenetycznej, oparte o strukturę chromatyny roślin naczyniowych.

 




Regulacja ekspresji genowej, synteza i struktura białek. Terminalne białko wirusa ziemniaka Y

Kierownik Zespołu: dr hab. Ewa Szołajska
Zespół:
dr hab. Jadwiga Chroboczek, mgr Izabela Wojtal (doktorantka)

Potywirusy należą do rodziny pikornawirusów, których materiał genetyczny stanowi pojedyncza nić RNA(+). Wirus Y ziemniaka (PVY) jest powszechnie występującym wirusem powodującym szkody w rolnictwie. Na końcu 5’ RNA wirusów roślinnych należących do rodziny potywirusów znajduje się kowalencyjnie przyłączone białko VPg. Stanowi ono istotny czynnik wirulencji, ponieważ wirus pozbawiony VPg traci całkowicie infekcyjność. Jednakże rola VPg w cyklu życiowym wirusa nie jest wyjaśniona. VPg jest zaangażowane w proces translacji, transportu w obrębie tkanki roślinnej oraz replikacji. Wykazano oddziaływanie VPg z wirusową polimerazą RNA, co wskazuje na jego udział w syntezie RNA wirusowego. Białka VPg potywirusów są zaangażowane w modulowanie oporności roślin na infekcję wirusową poprzez oddziaływanie z czynnikiem inicjacji translacji gospodarza eIF4E, co wykazano zarówno w infekowanych komórkach jak i w układzie in vitro. Wykazano, że naturalna oporność roślin na potywirusy wynika z braku oddziaływania pomiędzy VPg i eIF4E w wyniku mutacji zachodzących w tych białkach.
 

Realizowane projekty:
Badania dotyczące białka VPg wirusów roślinnych mają za zadanie realizację dwóch celów. Pierwszym z nich jest identyfikacja fragmentu VPg odpowiedzialnego za oddziaływanie z czynnikiem inicjacji translacji eIF4E zainfekowanego gospodarza. Drugim celem jest identyfikacja innych czynników gospodarza oddziaływujących z białkiem VPg. Takie podejście powinno umożliwić lepsze zrozumienie nowego mechanizmu, dzięki któremu wirus zapewnia sobie odpowiedni przebieg cyklu życiowego.

Projekty badawcze:

2009-2010 Wirusowe białko VPg, badania strukturalne i funkcjonalne (Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego)
2007-2009 Oddziaływanie terminalnego białka wirusa Y ziemniaka, VPg, ze składnikami komórek gospodarza (Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego)

Patent:

J. Chroboczek, R. Grzela, W. Ostoja- Zagórski. Cell-proliferation inhibiting VPg proteins, fragments or analogs thereof and their applications, WO2008/152527

 

Wybrane publikacje:

  1. Grzela R., Szołajska E., Ebel C., Madern D., Favier A., Wojtal I., Zagórski W., Chroboczek J. Virulence Factor of Potato Virus Y, Genome-attached Terminal Protein VPg, Is a Highly Disordered Protein. J. Biol. Chem. (2008) 283: 213-221
  2. Strokovskaia L.I., Grzela R., Chroboczek J., Kikhno I.M., Chashchina L.I., Solomko A.P. Complex formation between recombinant protein VPg of potato virus Y and heterologous eukaryotic translation initiation factors eIF4E. Ukr. Biokhim. Zh. (2007) 79(1): 85-93
  3. Grzela R., Strokovska L., Andrieu J.P., Dublet B., Zagorski W., Chroboczek J. Potyvirus terminal protein VPg, effector of host eukaryotic initiation factor eIF4E. Biochimie. (2006) 88(7): 887-96


Regulacja ekspresji genowej, synteza i struktura białek. Badania nad strukturą i funkcją białek owadzich. Synteza białek biologicznie czynnych w heterologicznych systemach ekspresyjnych

Kierownik Zespołu: dr hab. Krystyna Grzelak
Zespół: dr Edyta Kopera, dr Anżeła Dwornyk, dr Małgorzata Milner, mgr Marcin Mielecki (doktorant)

W naszym laboratorium prowadzone są badania nad strukturą i funkcją wybranych rekombinowanych białek mogących znaleźć zastosowanie w biotechnologii (białko SPI, ang. silk proteinase inhibitor), rolnictwie (białko wiążące hormon juwenilny, JHBP) czy też medycynie (kinazy Jak i RIO).
Rekombinowany SPI-His6 otrzymany w systemie Pichia pastoris jest silnym inhibitorem proteaz serynowych bakteryjnych i grzybowych. Wykazano, że rSPI dołączony do wybranych białek docelowych jest zdolny do ich ochrony przed degradacją.  Struktura przestrzenna tego białka została opisana za pomocą techniki NMR.
Badania nad otrzymanym w systemie P. pastoris białkiem wiążącym hormon juwenilny dotyczą, w znacznej mierze, charakterystyki glikanów dołączonych do cząsteczki białka. Badania nad identyfikacją miejsca w cząsteczce rJHBP-His8 wiążącego ligand (ligandy) są w toku.
Zarówno rSPI-His6 jak i rJHBP-His8 zostały użyte jako białka modelowe do badania, przy pomocy elektrochemicznych sensorów, oddziaływań białko-przeciwciało i białko-hormon (współpraca z Instytutem Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności PAN, Olsztyn, Prof. H. i J. Radeccy). Opracowano dwa sensory. Pierwszy z nich, oparty o przeciwciała anty-His, umożliwia wykrycie białka posiadającego znacznik histydynowy (rSPI-His6) w podłożu hodowlanym już w stężeniu 5fg/ml. Drugi sensor umożliwia badanie oddziaływań rJHBP z hormonami juwenilnymi (JHs) i metoprenem. Wykazano, że rJHBP wiążąc zarówno JHs jak i metopren ulega zmianom konformacyjnym. Opracowany sensor może mieć znaczenie praktyczne do monitorowania w  środowisku metoprenu – powszechnie stosowanego insektycydu.
Prowadzono również badania nad otrzymywaniem rekombinowanej kinazy tyrozynowej Jak2 w systemie bakulowirusa oraz kinaz RIO 1 i 3 w komórkach E.coli i oczyszczaniem tych białek do homogenności.  Rekombinowana  domena katalityczna Jak2 została oczyszczona najpierw za pomocą chromatografii na GSH-agarozie a następnie Ni-NTA agarozie.
Aktywność katalityczną nadprodukowanych białek weryfikowano techniką autoradiograficzną przy użyciu [γ32P]ATP oraz testem luminescencyjnym. Badania nad oddziaływaniem enzymów z dostępnymi komercyjnie i nowo-syntetyzowanymi inhibitorami są w toku. Inhibitory kinaz Jak i RIO są potencjalnymi lekami przeciwnowotworowymi.

Realizowane projekty:

  1. Opracowanie immunosensora opartego o fragmenty Fab przeciwciała anty-His do wykrywania białek posiadających znacznik histydynowy.
  2. Poszukiwanie nowych inhibitorów onkogennych kinaz tyrozynowych Jak2 za pomocą automatycznego przeszukiwania biblioteki niskocząsteczkowych związków chemicznych w Centrum Screeningu bioaktywnych molekul (CMBA, Grenoble).

Projekty badawcze:

2009-2012
Makromolekuły biorące udział w transporcie białka wiążącego hormon juwenilny oraz ekspresji jego genu (Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego)
2005-2008 Zastosowanie biosensorów w biologii molekularnej (Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego)
2005-2008 Inhibitory kinaz białkowych jako potencjalne leki przeciwnowotworowe i przeciwwirusowe (Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego)
2005-2008 Struktura białka wiążącego hormon juwenilny, jego gen, elementy regulatorowe oraz ekspresja (Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego)
2003-2005 Nowa metoda odcinania etykiety powinowactwa przy oczyszczaniu białek (Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego)
2002-2004 Natural and recombinant protease inhibitors (NATO)

Patent:

Sehnal, F., Kodrik, D., Zurovec, M., Grzelak, K., Kludkiewicz, B., Milner, M., Zagorski-Ostoja, W. Design and use of Kazal-type proteinase inhibitors, WO2005/007693

 

Wybrane publikacje:

  1. Wasowicz M., Viswanathan S., Dvornyk A., Grzelak K., Kłudkiewicz B., Radecka H. Comparison of electrochemical immunosensors based on gold nano materials and immunoblot techniques for detection of histidine-tagged proteins in culture medium. Biosens. Bioelectron. (2008) 24: 284-289
  2. Grzelak K., Radecka H. Elektrochemiczna biosonda molekularna w badaniach oddziaływań białko-hormon. Na pograniczu chemii i biologii, Henryk Koroniak, Jan Barciszewski (red), Wydawnictwo Naukowe UAM w Poznaniu (2008) XX: 541-559
  3. Stobiecka A., Dvornyk A., Grzelak K., Radecka H. Electrochemical impedance spectroscopy for the study of juvenile hormones-recombinant protein interactions. Front. Biosci. (2008) 13: 2866-74
  4. Milner M., Grzelak K., Zhukov I., Zagórski-Ostoja W. Niestandardowe inhibitory proteaz – peptydy rodziny Kazala. Na pograniczu Chemii i Biologii, Wydawnictwo Naukowe Uniwersytetu A. Mickiewicza w Poznaniu (2008) XVII: 347-63
  5. Milner M., Chroboczek J., Zagorski-Ostoja W. Engineered resistance against proteinases. Acta Biochim. Pol. (2007) 54: 523-36
  6. Kłudkiewicz B., Kodrik D., Grzelak K., Nirmala X., Sehnal F. Structurally unique recombinant Kazal-type proteinase inhibitor retains activity when terminally extended and glycosylated. Protein Expr. Purif. (2005) 43: 94-102
  7. Dębski J., Wysłouch-Cieszyńska A., Dadlez M., Grzelak K., Kłudkiewicz B., Kołodziejczyk R., Lalik A., Ożyhar A., Kochman M. Positions of disulfide bonds and N-glycosylation site in juvenile hormone binding protein. Arch. Biochem. Biophys. (2004) 421: 260-266
  8. Grzelak K., Kłudkiewicz B., Kolomiets L.I., Dębski J., Dadlez M., Lalik A., Ożyhar A., Kochman M. Overexpression of juvenile hormone binding protein in bacteria and Pichia pastoris. Protein Expr. Purif. (2003) 31: 173-180

 


Regulacja ekspresji genowej, synteza i struktura białek. Dodekahedron adenowirusowy - wektor transferu wewnątrzkomórkowego. Dodekahedron adenowirusowy jako platforma szczepionkowa

Kierownik Zespołu: dr Ewa Szołajska
Zespół: prof. Włodzimierz Zagórski-Ostoja, dr hab. Jadwiga Chroboczek, dr Antonina Naskalska , mgr Monika Żochowska (doktorantka), mgr Inga Szurgot (doktorantka), mgr Małgorzata Białoskórska
   
Dodekahedron (Dd) jest mniejszą od wirusa czasteczką wirusopodobną (VLP od ang. virus like particle) zbudowaną z białka adenowirusa odpowiedzialnego za penetrację wirusa w momencie infekcji. Dzięki niezwykłej zdolności wnikania do komórek Dd jest bardzo atrakcyjnym narzędziem do wprowadzania czynników terapeutycznych.
Badane są dwa zastosowania Dd. Pierwszym z nich jest użycie Dd jako platformy dostarczającej antygeny szczepionki przeciwgrypowej. W proponowanym przez nas podejściu metodycznym antygeny są przyłączane do powierzchni oczyszczonych rekombinowanych Dd przy użyciu adaptora zawierającego domeny WW. Jako antygeny wybrano: hemaglutyninę - białko powierzchniowe łatwo ulegające mutacjom, oraz M1 - główne białko wewnątrzkapsydowe, o stabilniejszej sekwencji. Dodekahedryczna VLP będzie działać jako adjuwant, i wraz z eksponowanymi/prezentowanymi na powierzchni antygenami będzie indukować skuteczną ochronę przeciwko różnym szczepom grypy.
Wykazaliśmy, że niekowalencyjny kompleks Dd z M1 wydajnie wnika do ludzkich mieloidalnych komórek dendrytycznych (MDC od ang. myeloid dendritic cells), indukując ich dojrzewanie. W wyniku penetracji następuje wydajna prezentacja białka limfocytom T specyficznym dla immunodominującego epitopu białka M1. W następnym etapie planujemy przygotowanie szczepionki zawierającej oba antygeny i badanie jej skuteczności na zwierzętach zakażonych śmiertelną dawką wirusa.

Drugie zastosowanie dotyczy wykorzystania Dd do wprowadzania czynników terapeutycznych do tkanek nowotworowych. Jako leku wzorcowego użyto bleomycyny (BLM), antybiotyku o działaniu cytostatycznym, o ograniczonym przenikaniu przez błony komórkowe. Jak dotąd BLM jest używana w wysokich dawkach, wywołujących groźne skutki uboczne stosowanej chemioterapii. Przygotowano preparat dodekahedronu, do którego powierzchni przyłączono kowalencyjnie bleomycynę. Koniugat Dd-BLM wydajnie wnika do komórek nowotworowych w układzie in vitro, powodując ich śmierć. Skuteczne cytotoksyczne stężenie antybiotyku dostarczanego z Dd jest 100-krotnie niższe od stężenia stosowanego w przypadku wolnej BLM. Nasze badania są pierwszym przykładem skutecznego użycia zrekombinowanej czasteczki wirusopodobnej w celu zwiększenia biodostępności leku. Efekt działania preparatu Dd-BLM jest obecnie badany na modelu guzów złośliwych wszczepionych myszom.

Realizowane projekty:

  1. Dodekahedron adenowirusa jako wektor do wprowadzania czynników terapeutycznych do tkanek nowotworowych;
  2. Opracowanie nowej szczepionki przeciwgrypowej na platformie dodekahedronu adenowirusa.

Projekty badawcze:

2010-2012 Donosowa szczepionka przeciwgrypowa dla zwierząt (Ministerstwo Nauko i Szkolnictwa Wyższego)
2006-2008 Development of novel influenza vaccine for poultry (NATO)
2005-2008 Wykorzystanie dodekahedronu adenowirusowego do wprowadzania czynników terapeutycznych do komórek nowotworowych (Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego)
2005-2008 Inhibitory kinaz białkowych jako potencjalne leki przeciwnowotworowe i przeciwwirusowe (Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego)

Patenty:

Szołajska E., Chroboczek J., Żochowska M. Wektorowa cząsteczka wirusopodobna, sposób jej wytwarzania, zastosowanie wektorowej cząsteczki wirusopodobnej oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca wektorową cząsteczkę wirusopodobną (patent złożony w 2009) P 387 780
Chroboczek J., Szołajska E., Naskalska A. Wektorowa cząsteczka wirusopodobna, sposób jej wytwarzania, zastosowanie wektorowej cząsteczki wirusopodobnej oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca wektorową cząsteczkę wirusopodobną. (patent złożony w 2009) P388 403

Wybrane publikacje:

  1. Naskalska A., Szolajska E., Chaperot L., Angel J., Plumas J., Chroboczek J. Influenza recombinant vaccine: Matrix protein M1 on the platform of the adenovirus dodecahedron. Vaccine (2009) Sep 18. [Epub ahead of print]
  2. Zochowska M., Paca A., Schoehn G., Andrieu J.-P., Chroboczek J., Dublet B., Szolajska E. Adenovirus Dodecahedron, as a drug delivery vector. PLoS ONE (2009) 4(5): e5569
  3. Hong S.S., Szołajska E., Schoehn G., Franqueville L., Myhre S., Lindholm L., Ruigrok R.W., Boulanger P., Chroboczek J. The 100K-chaperone protein from adenovirus serotype 2 (Subgroup C) assists in trimerization and nuclear localization of hexons from subgroups C and B adenoviruses. J. Mol. Biol. (2005) 352:125-38

Sekwencjonowanie genomów wybranych szczepów wiroidów i roślinnych oraz ich detekcja. Molekularne podstawy infekcji wiroidowej 

Kierownik Zespołu: dr Anna Góra-Sochacka
Zespół: mgr Aneta Więsyk (doktorantka)

Prowadzone badania dotyczą wyjaśnienia mechanizmu patogenezy wiroida wrzecionowatości bulw ziemniaka (PSTVd). RNA wiroidowe nie koduje białek a mimo to replikuje się w komórkach gospodarza i wywołuje swoistą chorobę roślin. Proces infekcji musi więc być związany z bezpośrednim oddziaływaniem RNA wiroidowego z różnymi czynnikami obecnymi w komórkach gospodarza.

Projekt badawczy obejmuje porównawczą analizę profilu białek jądrowych wyrażanych w zdrowych i zainfekowanych roślinach z wykorzystaniem spektrometrii mas ze znakowaniem izotopowym iTRAQ. Do badań wybrano dwa izolaty: ostry PSTVd-S23 oraz łagodny PSTVd-M wywołujące wyraźnie odmienne symptomy chorobowe. Pierwszym etapem pracy była optymalizacja metody izolacji jąder komórkowych z roślin pomidora odmiany Rutgers. W celu otrzymania jak najczystszych preparatów przetestowano techniki oczyszczania poprzez wirowanie w gradiencie sacharozy i Percollu. Otrzymane preparaty porównywano oglądając pod mikroskopem konfokalnym po wybarwieniu DAPI a następnie poddawano analizie na spektrometrze mas w celu wystandaryzowania przebiegów HPLC.

Prowadzone są również badania dotyczące wpływu mutacji w wybranych domenach genomu PSTVd na jego żywotność. Do analizy wybrano otrzymane przez nas uprzednio warianty sekwencyjne ze zmutowanym 6-cio nukleotydowym regionem w domenie P (patogenności) oraz TL (terminalna lewa). W wybranych regionach genomu mutacje są spotykane bardzo rzadko dlatego analizowane mutanty wydają się być bardzo interesujące. Wszystkie są stabilne genetycznie i wywołują swoiste objawy chorobowe. Mutanty te zostaną wykorzystane w rozpoczętej porównawczej analizie proteomicznej.

Analiza porównawcza profilu białek jądrowych, których poziom produkcji w komórkach roślinnych ulega zmianie w wyniku infekcji PSTVd powinna przyczynić się do rozwiązania zagadki mechanizmu patogenezy wiroidowej.

Aktualne projekty:

  1. Porównawcza analiza proteomu jądrowego roślin zdrowych i zainfekowanych PSTVd;
  2. Identyfikacja białek jądrowych z rośliny pomidora związanych z procesem infekcji PSTVd.

Udział struktur chromatynowych w regulacji transkrypcji genów

Kierownik Zespołu: prof. dr hab. Andrzej Jerzmanowski

Zespół:

 

Projekty badawcze:

 

Wybrane publikacje

 


Dynamika transkryptomu w normie i stresie

Kierownik Zespołu: dr hab. Marta Koblowska

Zespół:

 

Projekty badawcze:

 

Wybrane publikacje:

 


Udział chromatyny w kontroli podstawowych procesów regulatorowych u Eukariota

Kierownik Zespołu: dr hab. Tomasz Sarnowski

Zespół:

 

Projekty badawcze:

 

Wybrane publikacje: