Zakład Genetyki

 

Kierownik Zakładu: prof. dr hab. Teresa Żołądek

 

Zakład Genetyki składa się z sześciu zespołów. Cztery zespoły używają drożdży Saccharomyces cerevisiae jako organizmu modelowego do badania różnych aspektów genetyki i fizjologii komórki eukariotycznej: genetycznej regulacji metabolizmu (dr hab. Róża Kucharczyk), mechanizmu transportu białek (prof. Teresa Żołądek), regulacji transkrypcji tRNA (prof. Magdalena Rakowska-Boguta), mechanizmów podziału komórki (prof. nadzw. dr hab. Anna Kurlandzka). Jedna grupa (prof. A Paszewski) używa grzyba nitkowatego Aspergillus nidulans i komórek drożdży do badania genetycznej kontroli metabolizmu siarkowego a jedna grupa (prof. nadzw. dr hab. Beata Burzyńska) przeprowadza analizę genetyczną wybranych chorób genetycznych u ludzi oraz używa drożdży jako modelu do badania funkcji wybranych genów ludzkich.

 




Gentyka i biologia molekularna grzybów. Regulacja transkrypcji tRNA u drożdży

Kierownik zespołu: Prof. Magdalena Boguta
Członkowie zespołu: Małgorzata Cieśla (Dr), Ewa Skowronek (Dr), Damian Graczyk (Dr), Ewa Makała (doktorantka), Marta Płonka (doktorantka), Dominika Foretek (doktorantka)

 

Wydajna transkrypcja tRNA i rRNA zapewnia produkcję 3 milionów cząsteczek tRNA i 300 tysięcy rybosomów w czasie jednego cyklu komórkowego. Ze względu na wysoki koszt energetyczny i konieczność skoordynowanego funkcjonowania rybosomów, transkrypcja tRNA przez polimerazę III RNA (Pol III) jest regulowana w odpowiedzi na sygnały zewnętrzne. W przypadku organizmu jednokomórkowego, jakim są drożdże Saccharomyces cerevisiae, taka kontrola zapewnia przeżycie w warunkach stresu dzięki optymalnemu wykorzystaniu składników pokarmowych. U organizmów wyższych regulacja Pol III jest sprzężona z proliferacją , a poziom transkrypcji tRNA jest regulowany przez p53, Rb i Myc , główne regulatory cyklu komórkowego. Stwierdzono, że defekt w regulacji Pol III wiąże się z transformacją nowotworową.
Zarówno struktura kompleksu Pol III jak i jej funkcja są zachowane w toku ewolucji. Pozwala to na wykorzystanie drożdży jako organizmu modelowego w badaniu mechanizmów odpowiedzialnych za regulację aktywności Pol III u eukariontów.
Prace prowadzone w pracowni prof. M. Boguty przyczyniły się do odkrycia mechanizmu regulacji transkrypcji tRNA przez białko Maf1. Gen kodujący to białko u drożdży został zidentyfikowany w tej pracowni przed laty, a dalsze badania doprowadziły do poznania mechanizmu regulacji Pol III przez Maf1.  Funkcja Maf1 jako regulatora Pol III jest zachowana w komórkach ludzkich, zaś Maf1 jest potencjalnym supresorem nowotworzenia.
Celem obecnych badań jest poznanie nowych mechanizmów regulacji transkrypcji Pol III.  Eksperymenty prowadzone są zarówno z wykorzystaniem drożdży jak i komórek ludzkich w hodowlach. 

Projekty badawcze:

 

2016-2018  "Regulacja RNA polimerazy III w makrofagach" (Narodowe Centrum Nauk)

                    Kierownik projektu: dr Damian Graczyk.
2015-2017   "Control of tRNA biogenesis" (Fundacja na Rzecz Nauki Polskiej)

                    Subsydium Mistrz dla M. Boguty z Fundacji na rzecz Nauki Polskiej

2012-2016   "Nowatorskie koncepcje regulacji transkrypcji tRNA" 
                     (Narodowe Centrum Nauki w Krakowie, Projekt Maestro; UMO-2012/04/A/NZ1/00052)
                     Kierownik projektu: Prof. M.Boguta
2011-2014   Sprzężenie aktywności polimerazy III RNA z metabolizmem glukozy u drożdży Saccharomyces cerevisiae
                    (Narodowe Centrum  Nauki w Krakowie, N301693740)
                    Kierownik grantu: Prof. M. Boguta
2010-2014   PhD programme in Molecular Biology: Studies of nucleic acids and proteins - from basic to applied research
                    (Fundacja na rzecz Nauki Polskiej, Projekt Międzynarodowe Studia Doktoranckie (MPD))
                    Koordynator grantu: Prof. M. Boguta

2011-2014   New proteins implicated in regulation of tRNA transcription in the yeast Saccharomyces cerevisiae
                    (Fundacja na rzecz Nauki Polskiej, Projekt Pomost)
                    Kierownik grantu: dr Małgorzata Cieśla

2009-2013   Koordynacja transkrypcji, dojrzewania i kontroli trwałości eukariotycznych tRNA.
                    (Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego, N301298837)
                    Kierownik grantu: Dr. J. Towpik
2009-2011   Regulacja transkrypcji z udziałem polimerazy III RNA u drożdży: Rola ewolucyjnie konserwowanych domen
                    represora Maf1.
                    (Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego N301 243236)
                    Kierownik grantu: Prof. M. Boguta
2008-2010   Rola kinazy CK2 w regulacji aktywności Maf1, represora transkrypcji tRNA u drożdży
                    (Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego N301 164035)
                    Kierownik grantu: Prof. M. Boguta
2007-2010   Regulacja transkrypcji tRNA u drożdży Saccharomyces cerevisiae
                    (Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego N301 023 32/1117)
                     Kierownik grantu: Prof. M. Boguta
2006-2008   Wyjaśnienie mechanizmu regulacji polimerazy III RNA w odpowiedzi na stres i podczas różnicowania
                    (Grant Polonium)
                     Kierownicy grantu: Dr Christine Conessa, CEA/Saclay Gif-sur-Yvette i Prof. M. Boguta
2005-2008   Genomika funkcjonalna mikroorganizmu modelowego w badaniach molekularnych dziedzicznych chorób u ludzi
                     i w badaniach mechanizmu patogenezy.
                     (Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego) 
                     Koordynator: Prof. J. Rytka
                     Część 8 projektu: Rola białka Maf1 jako potencjalnego supresora nowotworów. Mechanizm działania
                     i znalezienie powiązań regulacyjnych w kaskadzie przekazywania sygnałów
                     Kierownik części 8: Prof. Magdalena Boguta
2007-2008   Rola genów jądrowych w regulacji funkcjonowania mitochondriów u drożdży.
                    (Polska Sieć Mitochondrialna MITONET) 
                    Reprezentant  IBB w sieci MITONET: Prof. Magdalena Boguta

 

Wybrane publikacje:

 

  1. Foretek D, Wu J, Hopper AK & Boguta M (2016) Control of S.cerevisiae pre-tRNA processing by environmental conditions. RNA, w druku
  2. Boguta M (2015) Why Are tRNAs Overproduced in the Absence of Maf1, a Negative Regulator of RNAP III, Not Fully Functional? PLoS Genet. 2015 Dec 31;11(12): e1005743. doi: 10.1371/journal.pgen.1005743
  3. Long JS, Schoonen PM, Graczyk D, O'Prey J, Ryan KM. (2015) p73 engages A2B receptor signalling to prime cancer cells to chemotherapy-induced death. Oncogene. 34(40): 5152-62
  4. Graczyk D, White RJ, Ryan KM. Involvement of RNA Polymerase III in Immune Responses. (2015) Mol Cell Biol. 35(10): 1848-59
  5. Cieśla M, Makała M, Płonka M, Bazan R, Gewartowski K, Dziembowski A & Boguta M (2015) Rbs1, a new protein implicated in RNA polymerase III biogenesis in yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 35: 1169-1181
  6. Cieśla M, Mierzejewska J, Adamczyk M, Östlund Farrants A & Boguta M (2014) Fructose bisphosphate aldolase is involved in the control of RNA polymerase III-directed transcription. BBA-MCR 1843: 1103-1110
  7. Boguta M, Maf1, a general negative regulator of RNA polymerase III in yeast (2013) BBA-GRM 1828: 376-384
  8. Morawiec E,  Wichtowska D, Graczyk D, Conesa C, Lefebvre O & Boguta M (2013) Maf1, repressor of tRNA transcription, is involved in the control of gluconeogenetic genes in Saccharomyces cerevisiae. Gene 526: 16-22
  9. Wichtowska D, Turowski T & Boguta M (2013) An interplay between transcription, processing and degradation determines tRNA levels in yeast . WIREs RNA 6: 709-722
  10. Tomasz W. Turowski TW, Karkusiewicz I, Kowal J& Boguta M (2012) Maf1-mediated repression of RNA polymerase III transcription inhibits tRNA degradation via RTD pathway, RNA 18: 1823-1832
  11. Boguta M & Graczyk D (2011) RNA polymerase III under control: repression and de-repression. Trends Bioch Sci, 36, 451-456.
  12. Karkusiewicz I, Graczyk D, Turowski T, Towpik J, Dhungel N, Hopper A & Boguta M (2011) Maf1, repressor of RNA polymerase III RNA, indirectly affects tRNA processing. RNA, 18: 1823-1832
  13. Graczyk D, Dębski J, Muszyńska G, Bretner M, Lefebvre O & Boguta M (2011) CK2-mediated phosphorylation of general repressor Maf1 triggers RNA polymerase III activation. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 108, 4926-4931
  14. Gajda A, Towpik J, Steuerwald U, Müller CW, Lefebvre O & Boguta M (2010) Full repression of RNA polymerase III transcription requires interaction between two domains of its negative regulator Maf1. J Biol Chem 285, 35719-35727
  15. Boguta M.(2009) Control of RNA polymerase I and III by the TOR signaling pathway. Cell Cycle 8, 4023-4024.
  16. Sikora J,  Towpik J,  Graczyk D, Kistowski M, Rubel T,  Poznanski J, Langridge J, Hughes C, Dadlez M, Boguta M (2009)  Yeast prion [PSI+] depletes the levels of mitochondrial prohibitins. BBA-MCR. 1793:1703-1709
  17. Towpik, J, Graczyk D, Gajda A, Lefebvre O, Boguta M (2008) De-repression of RNA Polymerase III by phosphorylation and nuclear export of its negative regulator Maf1. J. Biol. Chem. 283: 17168-17174.
  18. Kutner J, Towpik J, Ginalski K & Boguta M (2008) Mitochondrial release factor in yeast: interplay of functional domains. Curr. Genet. 53:185-92.
  19. Cieśla M & Boguta M (2008) Regulation of RNA polymerase III transcription by Maf1 protein. Acta Biochim. Pol. 55: 215-225.
  20. Goodfellow SJ, Graham EL, Kantidakis T, Marshall L, Coppins BA, Oficjalska-Pham D, Gerard M, Lefebvre O, White RJ (2008) Regulation of RNA polymerase III transcription by Maf1 in mammalian cells. J. Mol. Biol. 378: 481-491
  21. Cieśla M, Towpik J, Graczyk D, Oficjalska-Pham D, Harismendy O, Suleau A, Balicki K, Conesa C, Lefebvre O & Boguta M (2007) Maf1 is involved in coupling carbon metabolism to RNA Polymerase III transcription. Mol Cell Biol 27, 7693-7702.
  22. Kutner J (2007) Terminacja translacji u eukariontów. Postępy Biochemii 53: 420-430
  23. Oficjalska-Pham, D. Harismendy O, Smagowicz WJ, Gonzales de Peredo A, Boguta M, Sentenac A & Lefebvre O (2006) General repression of RNA polymerase III transcription is triggered by protein phosphatase type 2A-mediated dephosphorylation of Maf1. Mol Cell , 22, 623-632.
  24. Claisse M, Boguta M & Zagórski W (2005) Translational readthrough of a termination codon in the yeast mitochondrial mRNA VAR1 as a result of mutation in the release factor mRF1. Acta Biochim. Pol. 52, 129-137.
  25. Kamińska J, Kwapisz M, Grabińska K, Orłowski J, Boguta M, Palamarczyk G, Żołądek T (2005) Rsp5 ubiquitin ligase affects isoprenoid pathway and cell wall organization in S. cerevisiae. Acta Biochim. Pol. 52: 207-220.
  26. Towpik J, Kutner J & Boguta M (2005) Expression of mitochondrial release factor in relation to respiratory competence in yeast. Curr Genet 48:101-108.
  27. Boguta M (2005) Termination in the yeast mitochondrial system: mutations in the MRF1 gene encoding release factor inhibit translation. Annual Report, Polish Academy of Sciences. 35-37.
  28. Towpik J, Chacińska A, Cieśla M, Ginalski K & Boguta M (2004) Mutations in the yeast MRF1 gene encoding mitochondrial release factor inhibit translation on mitochondrial ribosomes. J. Biol.Chem. 279: 14096-141003.

 



Genetyka i biologia molekularna grzybów. Genetyczna regulacja metabolizmu w drożdżach Saccharomyces cerevisiae

Kierownik Zespołu:prof. nadzw. dr hab. Róża Kucharczyk
Zespół: 
Dr Chiranjit Panja (Post-doc), dr Katarzyna Niedźwiecka (Post-doc), mgr Emilia Baranowska (doktorant), mgr Sylwia Pilch (doktorant), mgr. Soroosh Manon (doktorant), Izabela Chojnacka (magistrant), Aleksandra Wójcicka (licencjuszka)

 

Zakres badań 

Biogeneza, regulacja i defekty mitochondrialnej syntazy ATP: 1. S. cerevisiae jako modelowy organizm do badania skutków mutacji w genach mitochondrialnych ATP6 i ATP8; 2. Kontrola ekspresji podjednostek syntazy ATP kodowanych w mitochondrialnym DNA; 3. Biologiczna funkcja białka Fmp40 – jedynej znanej w drożdżach AMPylazy.

 

Tematyka badawcza 

Syntaza ATP jest enzymem zakotwiczonym w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, który syntetyzuje ATP w procesie fosforylacji oksydacyjnej. Enzym złożony jest z siedemnastu podjednostek, z których trzy u drożdży (a, 8 i c) a dwie u człowieka (a i 8), kodowane są w genomie mitochondrialnym. Biogeneza enzymu to wysoce złożony i konserwowany proces wymagający koordynacji ekspresji genów w genomie jądrowym i mitochondrialnym ze składaniem podjednostek do kompleksu. Aktywność syntazy ATP jest regulowana na wielu poziomach, jest skoordynowana z aktywnością łańcucha oddechowego, aktywność hydrolityczna jest regulowana przez naturalnie występujący w komórkach inhibitor domeny F1 – IF1. Zidentyfikowano szereg modyfikacji potranslacyjnych podjednostek syntazy ATP, fosforylacje, acetylacje, trimetylacje i inne. Jednak nie znane są ścieżki sygnałowe, które prowadzą do tych modyfikacji, w jakich tkankach czy warunkach one zachodzą oraz jak wpływają na aktywność enzymu. Dla nielicznych, np. fosforylacji podjednostki β u drożdży, pokazano, że ma znaczenie dla aktywności enzymatycznej syntazy ATP. 

Mutacje w genach kodujących podjednostki syntazy ATP, także białka niezbędne do jej prawidłowego złożenia w błonie mitochondrialnej, prowadzą do nieuleczalnych obecnie chorób neurodegeneracyjnych.

 

 

 

Badania naszej grupy obejmują cztery powiązane ze sobą zagadnienia:

 

1) Podjednostki syntazy ATP kodowane są w obu genomach: jądrowym i mitochondrialnym. Zajmujemy się kontrolą ekspresji genów mitochondrialnych syntazy ATP u drożdży, koordynacją syntezy mitochondrialnych podjednostek z ich wbudowywaniem się do enzymu.

 

2) Różne tkanki u organizmów wyższych mają inne potrzeby energetyczne, również organizmy jednokomórkowe dostosowują swój metabolizm energetyczny do potrzeb. Deficyt ATP prowadzi do zaburzeń matabolicznych i do chorób mitochondrialnych, takich jak cukrzyca, choroby serca, nowotwory czy choroby neurodegeneracyjne. Nasze badania na modelu drożdżowym mają na celu zrozumienie mechanizmów molekularnych defektów funkcji syntazy ATP spowodowanych mutacjami w genach mitochondrialnych ATP6 i ATP8, kodujących podjednostki a i 8. Skonstruowaliśmy szczepy drożdży posiadające w genomie mitochondrialnym dziesięć spośród 48 opisanych mutacji związanych z miopatiami czy nowotworami. Zaproponowaliśmy mechanizm zaburzenia funkcji syntazy ATP dla każdej z nich (dla czterech z nich na poziomie molekularnym). Kontynuujemy badania włączając także mutagenezę genu ATP8 nie tylko w celu zrozumienia patologii choroby ale także w celu charakterystyki funkcji tej podjednostki, która nie jest sprecyzowana. Poszukujemy mechanizmów kompensujących mutacje w ATP6, badamy te, które juz opisaliśmy – aktywację biogenezy kompleksów mitochondrialnych przez dwa związki – oraz poszukujemy kolejnych związków chemicznych poprawiających aktywność enzymu z substytucją aminokwasową czy produkcję ATP na innych szlakach metabolicznych.

3) Odkryliśmy, że mitochondrialnie zlokalizowane ludzkie selenobiałko O (SelO) oraz jego homologi Fmp40 u drożdży i YdiU u E. coli, sklasyfikowane przez naszych współpracowników do rodziny pseudokinaz, posiadają aktywność AMPylazy. Przyłączają one AMP do reszt tyrozyny, treoniny czy seryny substratów białkowych. Jest to jedyna znana AMPylaza u drożdży, a druga u człowieka. Jedną z funkcji tych białek jest regulacja S-glutationylacji białek poprzez AMPylację białek z rodziny glutaredoksyn w warunkach stresu oksydacyjnego. Kontynuujemy badania mające na celu identyfikację innych niż glutaredoksyny substratów Fmp40 oraz zrozumienie funkcji tego białka w regulacji fosforylacji oksydacyjnej. 

4) Nasza grupa jest jedną z nielicznych na świecie modyfikujących genom mitochondrialny drożdży. Wykorzystaliśmy te umiejętność do stworzenia szczepu reporterowego do detekcji lokalizacji w macierzy białek o podwójnej lokalizacji w komórce. Genom mitochondrialny tego szczepu (zdolnego do oddychania) zawiera fragment genu GFP (Split-GFP-β1-10) kodujący nie fluorescencyjną część białka GFP – pierwszych 10 jego beta-kartek. Białko to uzyskuje fluorescencję dopiero po samo-złożeniu się z brakującą 11-tą beta-kartką (β11), która znajdzie się w macierzy jedynie wraz z białkiem tam zlokalizowanym. Gen kodujący białko, którego lokalizację badamy klonujemy do plazmidu w fuzji z fragmentem genu GFP- β11, kodującym ostatnią 11-tą beta-kartkę. Dzięki temu uzyskaliśmy szczep reporterowy do detekcji lokalizacji w macierzy białek, który nie pozwala na wykrycie fluorescencji zanim badane białko do macierzy dotrze, ponieważ obie części białka GFP syntetyzowane są w dwóch różnych kompartmentach w komórce. W dalszej pracy chcemy uzyskać szczepy reporterowe drożdży do badania lokalizacji białek w przestrzeni mitochondrialnej, eksprymujące z genomu mitochondrialnego GFP-β1-10, które będzie się lokalizować w błonie wewnętrznej od strony przestrzeni mitochondrialnej.

 

Współpracujemy z:

prof. Jean-Paul di Rago, dr Alain Dautant, Institute of Biochemistry and Cell Genetics, CNRS, Bordeaux, (France); 

prof. Hubert Becker, Strasburg University (France); 

prof. Thomas Meyer, Imperial College London, UK;

prof. Christos Chinopoulos, Semmelweis University, Budapest (Hungary)

prof. Paolo Bernardi, University o Padova (Italy); 

prof. Vincent Tagliabracci, UT Southwestern Medical Center (USA);

prof. Małgorzata Łobocka (IBB PAS, Poland)

prof. Krzysztof Pawłowski, Warsaw University of Life Science (Poland).

Finansowanie:

2019-2023

 

2017-2020

“Regulation of cell death and OXPHOS activity by Fmp40 AMPylase in yeast S. cerevisiae”. NCN project nr UMO-2018/31/B/NZ3/01117

 

„Understanding of the functioning of the mitochondrial ATP synthase by studying in yeast the phenotype of human pathology related mutations in the mitochondrial DNA”. NCN project nr UMO-2016/23/B/NZ3/02098





Wybrane publikacje:

  1. Kucharczyk R, Dautant A, Gombeau K, Godard F, Tribouillard-Tanvier D, di Rago JP. (2019) The pathogenic MT-ATP6 m.8851T>C mutation prevents proton movements within the n-side hydrophilic cleft of the membrane domain of ATP synthase. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1860(7):562-57. 
  2. Kucharczyk R, Dautant A, Godard F, Tribouillard-Tanvier D, di Rago JP. Functional investigation of an universally conserved leucine residue in subunit a of ATP synthase targeted by the pathogenic m.9176 T>G mutation. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 2019; 1860(1):52-59, PMID: 30414414
  3. Carraro M, Checchetto V, Sartori G, Kucharczyk R, di Rago JP, Minervini G, Franchin C, Arrigoni G, Giorgio V, Petronilli V, Tosatto SCE, Lippe G, Szabó I, Bernardi P. High-Conductance Channel Formation in Yeast Mitochondria is Mediated by F-ATP Synthase e and g Subunits. Cell Physiol Biochem. 2018; 50(5):1840-1855, PMID: 30423558
  4. Sreelatha A, Yee SS, Lopez VA, Park BC, Kinch LN, Pilch S, Servage KA, Zhang J, Jiou J, Karasiewicz-Urbańska M, Łobocka M, Grishin NV, Orth K, Kucharczyk R, Pawłowski K, Tomchick DR, Tagliabracci VS. Protein AMPylation by an Evolutionarily Conserved Pseudokinase. Cell. 2018; 175(3):809-821.e19, PMID: 30270044
  5.  de Taffin de Tilques M, Lasserre JP, Godard F, Sardin E, Bouhier M, Le Guedard M, Kucharczyk R, Petit PX, Testet E, di Rago JP, Tribouillard-Tanvier D. Decreasing cytosolic translation is beneficial to yeast and human Tafazzin-deficient cells. Microb Cell. 2018; 5(5):220-232. PMID: 29796387
  6.  Skoczeń N, Dautant A, Binko K, Godard F, Bouhier M, Su X, Lasserre JP, Giraud MF, Tribouillard-Tanvier D, Chen H, di Rago JP, Kucharczyk R. Molecular basis of diseases caused by the mtDNA mutation m.8969G>A in the subunit a of ATP synthase. BBA-BIO 2018; 1859(8):602-611. PMID: 29778688
  7.  Klim J, Gładki A, Kucharczyk R, Zielenkiewicz U, Kaczanowski S. Ancestral State Reconstruction of the Apoptosis Machinery in the Common Ancestor of Eukaryotes. G3 (Bethesda). 2018; 8(6):2121-2134. PMID: 29703784
  8.  Dautant A, Meier T, Hahn A, Tribouillard-Tanvier D, di Rago JP, Kucharczyk R. ATP Synthase Diseases of Mitochondrial Genetic Origin. Front Physiol. 2018; 9:329. Review. PMID: 29670542
  9.  Chen E, Kiebish MA, McDaniel J, Niedzwiecka K, Kucharczyk R, Ravasz D, Gao F, Narain NR, Sarangarajan R, Seyfried TN, Adam-Vizi V, Chinopoulos C. Perturbation of the yeast mitochondrial lipidome and associated membrane proteins following heterologous expression of Artemia-ANT. Sci Rep. 2018; 8(1):5915. PMID: 29651047
  10.  Niedzwiecka K, Tisi R, Penna S, Lichocka M, Plochocka D, Kucharczyk R. Two mutations in mitochondrial ATP6 gene of ATP synthase, related to human cancer, affect ROS, calcium homeostasis and mitochondrial permeability transition in yeast. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 2018; 1865(1):117-131. PMID: 28986220
  11.  Wen S, Niedzwiecka K, Zhao W, Xu S, Liang S, Zhu X, Xie H, Tribouillard-Tanvier D, Giraud MF, Zeng C, Dautant A, Kucharczyk R, Liu Z, di Rago JP, Chen H. Identification of G8969>A in mitochondrial ATP6 gene that severely compromises ATP synthase function in a patient with IgA nephropathy.  Sci Rep. 2016; 6:36313. PMID: 27812026 
  12.  Żurawik TM, Pomorski A, Belczyk-Ciesielska A, Goch G, Niedźwiedzka K, Kucharczyk R, Krężel A, Bal W. Revisiting Mitochondrial pH with an Improved Algorithm for Calibration of the Ratiometric 5(6)-carboxy-SNARF-1 Probe Reveals Anticooperative Reaction with H+ Ions and Warrants Further Studies of Organellar pH. PLoS One. 2016; 11(8):e0161353. PMID: 27557123
  13.  Niedzwiecka K, Kabala AM, Lasserre JP, Tribouillard-Tanvier D, Golik P, Dautant A, di Rago JP, Kucharczyk R Yeast models of mutations in the mitochondrial ATP6 gene found in human cancer cells.  Mitochondrion. 2016;29:7-17. PMID: 27083309
  14.  Lasserre JP, Dautant A, Aiyar RS, Kucharczyk R, Glatigny A, Tribouillard-Tanvier D, Rytka J, Blondel M, Skoczen N, Reynier P, Pitayu L, Rötig A, Delahodde A, Steinmetz LM, Dujardin G, Procaccio V, di Rago JP. Yeast as a system for modeling mitochondrial disease mechanisms and discovering therapies. Dis Model Mech. 2015; 8(6):509-26. Review. PMID: 26035862
  15.  Aiyar RS, Bohnert M, Duvezin-Caubet S, Voisset C, Gagneur J, Fritsch ES, Couplan E, von der Malsburg K, Funaya C, Soubigou F, Courtin F, Suresh S, Kucharczyk R, Evrard J, Antony C, St Onge RP, Blondel M, di Rago JP, van der Laan M, Steinmetz LM. Mitochondrial protein sorting as a therapeutic target for ATP synthase disorders. Nat Commun. 2014 Dec 18;5:5585 PMID: 25519239

     

  16. Kabala AM, Lasserre JP, Ackerman SH, di Rago JP, Kucharczyk R. Defining the impact on yeast ATP synthase of two pathogenic human mitochondrial DNA mutations, T9185C and T9191C. Biochimie. 2014; 100:200-6. PMID: 24316278

Genetyka i biologia molekularna grzybów. Genetyczna regulacja metabolizmu siarki u grzybów

Kierownik Zespołu: prof. dr hab. Andrzej Paszewski
Zespół: dr Jerzy Brzywczy, dr Marzena Sieńko

Grzyby posiadają zdolność asymilacji nieorganicznej siarki do syntezy cysteiny i metioniny, które są składnikami białek i substratami do syntezy innych organicznych związków siarkowych. Badania prowadzone są głownie na grzybie nitkowatym Aspergillus nidulans, który jest jednym z głównych modeli grzybowych w badaniach molekularnych i genetycznych. Zainteresowania skupione są na regulacji alternatywnych dróg biosyntezy wspomnianych wyżej aminokwasów przez dwa systemy regulacyjne: metaboliczną represję siarkową (MRS), która reprymuje szlak asymilacji siarczanu w warunkach nadmiaru cysteiny, oraz tzw. regulon homocysteinowy, obejmujący geny kodujące enzymy metabolizujące  homocysteinę , których ekspresja wzrasta przy nadmiarze tego aminokwasu (w tych warunkach staje się on toksyczny). Zidentyfikowaliśmy gen metR  kodujący specyficzny dla genów siarkowych  czynnik transkrypcyjny oraz geny scon (sulfur controller) wchodzące w skład ligazy ubikwitynowej inaktywującej czynnik MetR w warunkach nadmiaru cysteiny.

Badana też jest rola paraloga czynnika MetR, kodowanego przez gen metZ. Prowadzona jest też analiza proteomiczna i transkryptomiczna mutantów wytwarzających bądź duży nadmiar związków siarkowych bądź ich niedomiar w celu sprawdzenia jak te zaburzenia w metabolizmie odbijają się na profilu białkowym i transkrypcyjnym komórki.

 

Projekty badawcze:

2009-2012 Zmiany profilu białkowego i transkrypcyjnego w mutantach regulatorowych Aspergillus nidulans jako konsekwencja nadprodukcji lub niedoboru związków Siarkowych (Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego)

Wybrane publikacje:

  1. Sieńko M., Natorff R., Owczarek S., Olewicki I., Paszewski A.
    Aspergillus nidulans genes encoding reverse transsufuration enzymes  belong to homocysteine regulon.
    Curr. Genetics
    (2009) 55: 561-570
  2. Piłsyk S., Paszewski A.
    The Aspergillus nidulans pigP gene encodes a subunit of GPI-N-acetylglucosaminyltransferase which influences filamentation and protein secretion.
    Curr. Genetics
    (2009) 55 :301-309
  3. Wortman J.R. (and many authors including S. Piłsyk, A. Paszewski)
    The 2008 update of Aspergillus nidulans genome annotation: A community effort.
    Fungal Genetics and Biology (2009) 46: S2 – S13
  4. Wróbel M., Lewandowska I., Bronowicka-Adamska P., Paszewski A.
    The level of sulfane sulfur in the fungus Aspergillus nidulans wild type and mutant strains.
    Amino Acids
    (2009) 37: 565-571

Genetyka i biologia molekularna grzybów. Mechanizmy transportu białek u drożdży Saccharomyces cerevisiae

Kierownik Zespołu: prof. dr hab. Teresa Żołądek

1. Zakład

Zakład Genetyki. Genetyka i biologia molekularna grzybów. Mechanizmy transportu białek u drożdży Saccharomyces cerevisiae

2.Zakres badań

Mechanizmy transportu białek między organellami i błoną komórkową oraz rola szkieletu aktynowego i lipidów w tym transporcie. Miejsca kontaktu błon, ich struktura i funkcja w transporcie lipidów, jonów metali i przekazywaniu sygnałów. Rola białek z rodziny Vps13, uwikłanych w patogenezę chorób neurodegeneracyjnych, w wymienionych procesach.

3.Opis badań

Białka Vps13 odgrywają ważną rolę w zdrowych i chorobowo zmienionych komórkach u ludzi, ale ich funkcja molekularna pozostaje niejasna. Rzadka choroba neurodegeneracyjna pląsawica-akantocytoza (ChAc) jest spowodowana mutacjami w genie hVPS13A. Białko hVps13A oddziałuje z aktyną i reguluje poziom fosforanu fosfatydyloinozytolu-4 (PI4P) w błonach komórek nerwowych. Drożdżowe białko Vps13 jest zaangażowane w transport wakuolarny i, podobnie jak hVps13A, bierze udział w metabolizmie PI4P i innych procesach (Ryc. 1). Białka Vps13 są zachowane u eukariontów (Ryc. 2). Jedna z mutacji znajdowanych u chorych na ChAc powoduje podstawienie reszty aminokwasowej I2771R, które wpływa na lokalizację białka hVps13A w komórkach mięśni szkieletowych. W celu zbadania mechanizmu patogenezy I2771R skonstruowaliśmy i zanalizowaliśmy szczep drożdży niosący równoważną mutację. Pokazaliśmy, że u drożdży podstawienie I2749R powoduje dysfunkcję białka Vps13 w endocytozie i transporcie wakuolarnym, podczas gdy poziom komórkowy białka jest niezmieniony, co sugeruje utratę jego funkcji. Pokazaliśmy też, że Vps13 podobnie jak hVps13A wpływa na organizację cytoszkieletu aktynowego i wiąże aktynę w eksperymentach z użyciem metody immunoprecypitacji. Vps13-I2749R też wiąże aktynę, ale nie funkcjonuje w organizacji cytoszkieletu aktynowego. Ponadto pokazaliśmy, że Vps13 poprzez domeny SHR_BD i APT1 wiąże fosfolipidy, szczególnie fosforan fosfatydyloinozytolu-3 (PI3P) (Ryc. 2), a substytucja I2749R zmniejsza tę zdolność. Również lokalizacja Vps13-GFP w komórce była zmieniona, gdy endosomalny poziom PI3P był obniżony, co wskazuje na przemieszczanie się tego białka w endosomalnym systemie błon. Wyniki te sugerują, że PI3P reguluje funkcjonowanie Vps13 w transporcie białek i organizacji cytoszkieletu aktynowego. Zmniejszenie zdolności do wiązania PI3P przez zmutowane białko hVPS13A może być jedną z przyczyn zmiany jego lokalizacji i braku funkcji w komórkach pacjentów cierpiących na ChAc (Rzepnikowska et al., 2017, Hum Mol Genet 26(8):1497-1510. doi: 10.1093/hmg/ddx054).

https://academic.oup.com/hmg/article/26/8/1497/3058773

 

Rycina 1. Lokalizacja i udział Vps13 w różnych procesach komórkowych u drożdży. Miejsca lokalizacji subkomórkowej Vps13-GFP są oznaczone w odcieniach zielni oraz wskazane są procesy, w których białko to bierze udział. Miejsca kontaktu błon: NVJ, ang. ER-derived nuclear envelope-vacuole junctions; vCLAMP, ang. vacuole and mitochondria patch; EMJ, ang. endosome–mitochondria junctions; ERMES, ang. endoplasmic reticulum mitochondria encounter structure. Struktury komórkowe: CW, ściana komórkowa; EE, wczesny endosom; ER, reticulum endoplaznatyczne; LE, późny endosom; Mito, mitochondrium; PM, błona komórkowa (Rzepnikowska W. et al., Traffic 18:711-719. doi: 10.1111/tra.12523, zmodyfikowane).

 

Rycina 2. Struktura białek, drożdżowego Vps13 i ludzkiego hVps13A.
Struktura domenowa białek Vps13 w oparciu o bazę danych Pfam i analizę wykonaną z użyciem programu Phyre2. Regiony drożdżowego białka Vps13, które wiążą wymienione lipidy in vitro, są zaznaczone liniami poziomymi: LPA, kwas lyzofosfatydowy; PA, kwas fosfatydowy; PI, fosfatydyloinozytol; PIPs, fosforylowane pochodne PI; PI3P, 3 fosforan PI; PI4P, 4 fosforan PI; PI5P, 5 fosforan PI; PI(3,5)P2, 3,5 bifosforan PI; PI(4,5)P2, 4,5 bifosforan PI; PS, fosfatydyloseryna. Nazwy domen w kolejności pojawiania się w strukturze białka: Chorein_N, N-końcowy region Choreiny; Vps13, N-końcowa domena Vps13 (PF16908); VPS13_mid_rpt, powtórzony region Vps13 (PF16910); SHR_BD (poprzednio DUF1162), SHR ang. (SHORT-ROOT transcription factor)-binding domain (PF06650); APT1, domena homologiczna do białka Zea mays ang. aberrant pollen transmission 1 (APT1) (PF10351); ATG_C, domena ang. autophagy-related protein C-terminal (PF09333); PH, domena ang. pleckstrin homology (PF00169). (Rzepnikowska et al., Traffic 18:711-719. doi: 10.1111/tra.12523, zmodyfikowana).

 

4. Lab members

Dr hab. Joanna Kamińska

Mgr Piotr Soczewka, doktorant

Mgr Damian Kołakowski, doktorant

Mgr Patrycja Wardaszka, doktorant

 

5. Publikacje i patenty

1. Rzepnikowska W, Kaminska J, Kabzińska D, Kochański A. (2020) Pathogenic Effect of GDAP1 Gene Mutations in a Yeast Model. Genes (Basel). 2020 Mar 14;11(3). pii: E310. doi: 10.3390/genes11030310.

2. Soczewka P, Kolakowski D, Smaczynska-de Rooij I, Rzepnikowska W, Ayscough KR, Kaminska J, Zoladek T. (2019) Yeast-model-based study identified myosin- and calcium-dependent calmodulin signalling as a potential target for drug intervention in chorea-acanthocytosis. Dis Model Mech. Jan 28;12(1). pii: dmm036830. doi: 10.1242/dmm.036830.

3. Kaminska J, Kolakowski D. (2018) Białka z rodziny Vps13: od funkcji molekularnej do patogenezy chorób neurodegeneracyjnych. Postępy Biochemii 64(4):275-287. doi: 10.18388/pb.2018_141

4. Rzepnikowska W, Flis K, Muñoz-Braceras S, Menezes R, Escalante R, Zoladek T. (2017) Yeast and other lower eukaryotic organisms for studies of Vps13 proteins in health and disease. Traffic 18:711-719. doi: 10.1111/tra.12523. Review.

5. Rzepnikowska W, Flis K, Kaminska J, Grynberg M, Urbanek A, Ayscough KR, Zoladek T. (2017) Amino acid substitution equivalent to human chorea-acanthocytosis I2771R in yeast Vps13 protein affects its binding to phosphatidylinositol 3-phosphate. Hum Mol Genet 26(8):1497-1510. doi: 10.1093/hmg/ddx054.

6. Krol K, Jendrysek J, Debski J, Skoneczny M, Kurlandzka A, Kaminska J, Dadlez M, Skoneczna A. (2017) Ribosomal DNA status inferred from DNA cloud assays and mass spectrometry identification of agarose-squeezed proteins interacting with chromatin (ASPIC-MS). Oncotarget 8(15):24988-25004. doi: 10.18632/oncotarget.15332.

7. Kaminska J, Rzepnikowska W, Polak A, Flis K, Soczewka P, Bala K, Sienko M, Grynberg M, Kaliszewski P, Urbanek A, Ayscough K, Zoladek T. (2016) Phosphatidylinositol-3-phosphate regulates response of cells to proteotoxic stress. Int. J. Bioch. Cell Biol. 79:494-504. 

8. Klionsky DJ, Abdelmohsen K,… Zoladek T…. et al., (2016) Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12:1-222. 

9. Jastrzebska Z, Kaminska J, Chelstowska A, Domanska A, Rzepnikowska W, Sitkiewicz E, Cholbinski P, Gourlay C, Plochocka D, Zoladek T. (2015) Mimicking the phosphorylation of Rsp5 in PKA site T761 affects its function and cellular localization Eur. J. Cell Biol. 94:576-588. 

10. Chelstowska A, Jastrzebska Z, Kaminska J, Sadurska A, Plochocka D, Rytka J, Zoladek T. (2015) Hem12, an enzyme of heme biosynthesis pathway, is monoubiquitinated by Rsp5 ubiquitin ligase in yeast cells. Acta Biochim. Pol. 62(3):509-15. 

11. Maciejak A., Leszczynska A., Warchol I., Gora M., Kaminska J., Plochocka D., Wysocka-Kapcinska M., Tulacz D., Siedlecka J., Swiezewska E., Sojka M., Danikiewicz W., Odolczyk N., Szkopinska A., Sygitowicz G., Burzynska B. (2013) The effects of statins on the mevalonic acid pathway in recombinant yeast strains expressing human HMG-CoA reductase. BMC Biotechnology 13(1):68. doi: 10.1186/1472-6750-13-68. 

12. Klionsky DJ, Abdalla FC, Abeliovich H… Zoladek T,… et al. (2012) Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy 8:445-544.

Patent Nr P 385243 “Nowy zmodyfikowany szczep drożdżowy, zwłaszcza Saccharomyces cerevisiae, sposób jego wytwarzania i zastosowanie” [zgłoszony 2008, przyznany 2016].

 

 

 


Analiza genetyczna podstaw wybranych chorób dziedzicznych

Kierownik Zespołu: Dr hab. Beata Burzyńska,

Zespół: Dr Monika Góra, Mgr Agata Maciejak (doktorantka), Mgr Dorota Tułacz (doktorantka)

 

Główne kierunki badań:

  1. Wyznaczenie biomarkerów genetycznych (na poziomie mRNA i miRNA) prowadzących do pozawałowej przebudowy lewej komory mięśnia sercowego. Badania są prowadzone przy wykorzystaniu szczurzego modelu eksperymentalnego oraz próbek krwi pobranych od pacjentów po przebytym zawale serca. Projekt pozwoli na określenie czynników genetycznych odgrywających rolę w pozawałowej niewydolności serca. Wykazaliśmy, że ocena ekspresji RNA izolowanego z leukocytów krwi obwodowej umożliwia identyfikację genów, których ekspresja zostaje istotnie zmieniona w ostrej fazie zawału mięśnia sercowego.
  2. Badania genetycznych uwarunkowań wrodzonych niedokrwistości hemolitycznych spowodowanych upośledzeniem aktywności enzymów krwinki czerwonej, zaburzeniami w budowie błony krwinki czerwonej oraz nieprawidłowościami w strukturze lub syntezie hemoglobiny.
  3. Badania molekularnych mechanizmów hipercholesterolemii w kontekście terapii statynowej. Stworzony przez nas drożdżowy system ekspresyjny umożliwia zbadanie wpływu zmian genetycznych, jak również rodzaju zastosowanej statyny lub innych inhibitorów na metabolizm komórkowy. Nasze wyniki wykazały, że taki model mógłby być pomocny w wyborze najskuteczniejszych form terapii, poprzez dobranie odpowiedniego leczenia dla danego pacjenta oraz zmniejszenia skutków ubocznych terapii.

 

Projekty badawcze: 

  • 2015-2018 „Transkryptomiczne biomarkery do stratyfikacji indywidualnego ryzyka rozwoju pozawałowej niewydolności serca”.Projekt w trakcie realizacji;
  • 2015-2017 „Ocena ekspresji krążących mikroRNA w patogenezie pozawałowej niewydolności mięśnia sercowego”
  • 2009 - 2015  „Badania systemowe czynników genetycznych choroby wieńcowej” 
  • 2006-2009 „Genomika funkcjonalna modelowych mikroorganizmów w badaniach molekularnych podłoża ludzkich choróbgenetycznych i patogenności” 
  • „Analiza genetycznego uwarunkowania anemii hemolitycznych”
  • „Wykorzystanie drożdży w badaniu genetycznego podłoża dysfunkcji śródbłonkowej”
  • 2005-2008 „Analiza mutacji w wybranych niedokrwistościach wrodzonych” w projekcie pt.: „Rozpoznawanie i etiopatogeneza niedokrwistości wrodzonych”.  
  • 2003-2006 „Opracowanie filtrów ekspresyjnych i zbadanie przy ich pomocy mutacji genowych warunkujących  niedobory białek błonowych krwinek czerwonych u chorych ze sferocytozą wrodzoną lub innymi rzadziej spotykanymi wadami wrodzonymi erytrocytów.” 

 

Wybrane publikacje:

  1. Warchol I, Gora M, Wysocka-Kapcinska M, Komaszylo J, Swiezewska E, Sojka M,Danikiewicz W, Plochocka D, Maciejak A, Tulacz D, Leszczynska A, Kapur S,Burzynska B.
    Genetic engineering and molecular characterization of yeast strainexpressing hybrid human-yeast squalene synthase as a tool for anti-cholesterol drug assessment.
    J Appl Microbiol. 2016 Apr;120(4):877-88. 
  2. Sygitowicz G, Maciejak A, Piniewska-Juraszek J, Pawlak M, Góra M, Burzyńska B, Dłużniewski M, Opolski G, Sitkiewicz D.
    Interindividual variability of atorvastatin treatment influence on the MPO gene expression in patients after acute myocardial infarction.
    Acta Biochim Pol. 2016;63(1):89-95.
  3. Szpakowicz A, Kiliszek M, Pepinski W, Waszkiewicz E, Franaszczyk M, SkawronskaM, Ploski R, Niemcunowicz-Janica A, Burzynska B, Tulacz D, Maciejak A, KaminskiMJ, Opolski G, Musial WJ, Kaminski KA.
    The rs12526453 Polymorphism in an Intron of the PHACTR1 Gene and Its Association with 5-Year Mortality of Patients with Myocardial Infarction.
    PLoS One. 2015 Jun 18;10(6):e0129820. 
  4. Maciejak A, Kiliszek M, Michalak M, Tulacz D, Opolski G, Matlak K, Dobrzycki S, Segiet A, Gora M, Burzynska B.
    Gene expression profiling reveals potential prognostic biomarkers associated with the progression of heart failure.
    Genome Med. 2015 Mar 14;7(1):26. 
  5. Tulacz D, Mackiewicz U, Maczewski M, Maciejak A, Gora M, Burzynska B.
    Transcriptional profiling of left ventricle and peripheral blood mononuclear cells in a rat model of postinfarction heart failure.
    BMC Med Genomics. 2013 Nov 8;6:49. 
  6. Gora M, Kiliszek M, Burzynska B.
    Will global transcriptome analysis allow the detection of novel prognostic markers in coronary artery disease and heart failure?
    Curr Genomics. 2013 Sep;14(6):388-96. 
  7. Maciejak A, Leszczynska A, Warchol I, Gora M, Kaminska J, Plochocka D, Wysocka-Kapcinska M, Tulacz D, Siedlecka J, Swiezewska E, Sojka M, Danikiewicz W, Odolczyk N, Szkopinska A, Sygitowicz G, Burzynska B.
    The effects of statins on the mevalonic acid pathway in recombinant yeast strains expressing human HMG-CoA reductase.
    BMC Biotechnol. 2013 Aug 30;13:68. 
  8. Rawa K, Adamowicz-Salach A, Matysiak M, Trzemecka A, Burzynska B.
    Coexistence of Gilbert syndrome with hereditary haemolytic anaemias.
    J Clin Pathol. 2012 Jul;65(7):663-5. 
  9. Kiliszek M, Burzynska B, Michalak M, Gora M, Winkler A, Maciejak A, Leszczynska A, Gajda E, Kochanowski J, Opolski G.
    Altered gene expression pattern in peripheral blood mononuclear cells in patients with acute myocardial infarction.
    PLoS One. 2012;7(11):e50054. 
  10. Kaczorowska-Hac B, Burzynska B, Plochocka D, Zak-Jasinska K, Rawa K, Adamkiewicz-Drozynska E. The first reported case of G6PD deficiency due to Seoul mutation in Poland.
    Ann Hematol. 2014 May;93(5):879-80. 
  11. Wysocka-Kapcinska M, Lutyk-Nadolska J, Kiliszek M, Plochocka D, Maciag M, Leszczynska A, Rytka J and  Burzynska B. Functional expression Wysocka-Kapcinska  of human HMG-CoA reductase in Saccharomyces cerevisiae: a system to analyze normal and mutated versions of the enzyme in the context of statin treatment.
    J Appl Microbiol 2009; 106(3):895-902. 
  12. Maciag M, Płochocka D, Adamowicz-Salach A, Burzyńska B.
    Novel beta-spectrin mutations in hereditary spherocytosis associated with decreased levels of mRNA.
    Br J Haematol 2009; 146(3):326-32.
  13. Maciag M, Adamowicz-Salach A, Siwicka A, Spychalska J, Burzynska B.
    The use of real-time PCR technique in the detection of novel protein 4.2 gene mutations that coexist with thalassaemia alpha in a single patient.
    Eur J Haematol 2009; 83(4):373-7.
  14. Pawlowski PH, Burzyńska B, Zielenkiewicz P.
    Theoretical model of thalassemic erythrocyte shape transformation
    J Theor Biol. 2008; 7;254(3):575-9. 
  15. Maciag M, Płochocka D, Adamowicz-Salach A, Jackowska T, Mendek-Czajkowska E, Pawelczyk A, Zdebska E, Burzynska B.
    Diversity of thalassaemia variants in Poland - screening by real-time PCR.
    Acta Haematol. (Basel) 2008; 120:153-157.
  16. Kiliszek M., Burzynska B., Styczynski G., Maciag M., Rabczenko D., Opolski G.
    A1166C polymorphism of the angiotensin AT1 receptor (ATIR) gene alters endothelial response to statin treatment.
    Clin. Chem. Lab. Med. 2007; 45: 839-842. 
  17. Pawlowski P.H., Burzynska B., Zielenkiewicz P.
    Theoretical model of reticulocyte to erythrocyte shape transformation.
    J. Theor. Biol. 2006; 243: 24-38.

Patenty i zgłoszenia patentowe:

  • Patent RP Nr 208956 -Sposób wykrywania i różnicowania chorób należących do grupy hemoglobinopatii, zwłaszcza talasemii. 
  • Patent RP Nr 386922-  Szczep drożdżowy przeznaczony do biologicznej walidacji inhibitorów szlaku kwasu mewalonowego, sposób jego wytwarzania oraz jego zastosowanie.
  • Zgłoszenie Patentowe P 407163 - Biomarkery transkryptomiczne, sposób określania i zastosowanie biomarkerów transkryptomicznych do stratyfikacjii indywidualnego ryzyka rozwoju pozawałowej niewydolności serca.
  • PCT/I82015/000141 - Transcriptomic biomarkers, method for determination thereof and use of transcriptomic biomarkers for individual risk assessment of developing post-infarction heart failure

 


Mechanizmy podziałów komórkowych

Kierownik Zespołu: dr hab. Anna Kurlandzka, prof. nadzw. IBB PAN

Zespół: dr Piotr Kowalec


Zajmujemy się segregacją chromosomów w mitozie i mejozie ze szczególnym uwzględnieniem kompleksu kohezyjnego chromatyd siostrzanych. Badania prowadzimy głównie na modelowym organizmie - drożdżach Saccharomyces cerevisiae, niektóre wyniki potwierdziliśmy także używając ludzkich linii komórkowych. Koncentrujemy się na kompleksie kohezyjnym chromatyd siostrzanych, niezbędnym do życia i zachowanym w ewolucji. Badamy głównie białko Irr1/Scc3, regulator kohezji zaangażowane także w inne procesy. Gen kodujący białko Irr1 został zidentyfikowany w naszym laboratorium i od tego czasu opublikowaliśmy kilka prac na jego temat. Mutacje w genie IRR1 prowadzą do zaburzeń w segregacji chromosomów, ale towarzyszą im także inne defekty, np. zaburzenia organizacji ściany komórkowej. Mogą one być związane z rolą białka Irr1 w procesach niezwiązanych z kompleksem kohezyjnym. 

Białko Irr1 jest obecne zarówno w jądrze jak też na terenie cytoplazmy. W poszukiwaniu niejądrowych funkcji Irr1 zidentyfikowaliśmy nowe białko z nim oddziałujące – Imi1 obecne w cytoplazmie. Brak Imi1 prowadzi do uszkodzeń mitochondriów i zaburza oddychanie komórkowe oraz wpływa na homeostazę glutationu. Oddziaływanie Irr1-Imi1 jest aktualnie badane w laboratorium.

Ludzkie homologi Irr1 – białka STAG1 i STAG2- również były badane pod kątem potencjalnej niejądrowej funkcji. Zaobserwowaliśmy, że STAG1 lokalizuje się wyłącznie w jądrze komórkowym, podczas gdy STAG2 przemieszcza się pomiędzy jądrem a cytoplazmą z wykorzystaniem mechanizmu zależnego od eksportyny Crm1.

 

Granty badawcze:

  • 2014-2016 “Connections between Irr1 protein involved in segregation of nuclear DNA and the newly identified mitochondrial protein Imi1 of Saccharomyces cerevisiae”, (Narodowe Centrum Nauki)
  • 2010-2013 "Nuclear import and export signals in human cohesin SA1 and SA2 identified during heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae", (Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego)
  • 2010-2014 "Post synthetic modifications and role of Irr1/Scc3 cohesin in meiosis initiation in  Saccharomyces cerevisiae", (Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego)

 

Ostatnie publikacje:

  1. Kowalec P, Grynberg M, Pająk B, Socha A, Winiarska K, Fronk J, Kurlandzka A (2015)
    Newly identified protein Imi1 affects mitochondrial integrity and glutathione homeostasis in Saccharomyces cerevisiae.
    FEMS Yeast Research 15 pii: fov048
  2. Tarnowski LJ, Milewski M, Fronk J, Kurlandzka A (2015)
    A compound C-terminal nuclear localization signal of human SA2 stromalin.
    Acta Biochim Pol. 62: 215-9
  3. Cena A, Skoneczny M, Chełstowska A, Kowalec P, Natorff R, Kurlandzka A (2013)
    Cohesin Irr1/Scc3 is likely to influence transcription in Saccharomyces cerevisiae via interaction with Mediator complex.
    Acta Biochim Pol. 60: 233-238
  4. Tarnowski LJ, Kowalec P, Milewski M, Jurek M, Plochocka D, Fronk J, Kurlandzka A (2012)
    Nuclear import and export signals of human cohesins SA1/STAG1 and SA2/STAG2 expressed in Saccharomyces cerevisiae.
    PLoS One 7: e38740
  5. Cena A, Kozłowska E, Płochocka D, Grynberg M, Ishikawa T, Fronk J, Kurlandzka A (2008).
    The F658G substitution in Saccharomyces cerevisiae cohesin Irr1/Scc3 is semi-dominant in the diploid and disturbs mitosis, meiosis and the cell cycle.
    Eur J Cell Biol. 87: 831-844

Genomika funkcjonalna odpowiedzi komórek eukariotycznych na stresy środowiskowe.

Kierownik Zespołu: dr hab. Marek Skoneczny

Zespół: dr Anna Chełstowska, dr Urszula Natkańska, mgr Błażej Kempiński, mgr Łukasz Rymer


1.
Stres jest nieodłącznym elementem życia wszelkich organizmów. Może pochodzić z zewnątrz, ze środowiska, w którym żyją, ale też jako uboczny skutek wielu procesów zachodzących wewnątrz ich komórek. Zatem poznanie zarówno samych stresów, jak i arsenału mechanizmów przeciwdziałających ich następstwom jest kluczowe dla zrozumienia praw rządzących Życiem na Ziemi.
Jedną z cech charakterystycznych stresu, zwłaszcza pochodzącego z zewnątrz, jest jego nieprzewidywalność. Dlatego organizm musi być odpowiednio przygotowany, by się z nim zmierzyć. Z drugiej strony trzymanie w gotowości całego potencjału obronnego przeciw wszelkim możliwym stresom byłoby niezwykle kosztownym obciążeniem zmniejszającym zdolność gatunku do przetrwania w starciu z konkurencją. Toteż odpowiedź na stres jest mechanizmem ściśle regulowanym. W komórkach wstawionych na jego działanie zachodzi gruntowne przeprogramowanie, którego jednym z elementów jest wielokrotny wzrost poziomów białek zapewniających ochronę przed stresem.
Organizmem o szczególnej przydatności w badaniach odpowiedzi komórek na stresy są drożdże Saccharomyces cerevisiae. Pełnią podwójną rolę. Nie tylko organizmu modelowego, jak w rozlicznych innych gałęziach badań podstawowych. Jest on również niezwykle ważnym organizmem wykorzystywanym w przemyśle spożywczym oraz do produkcji paliwa odnawialnego - etanolu. W takich industrialnych warunkach komórki drożdży napotykają na daleko silniejsze stresy niż w cieplarnianym otoczeniu laboratorium, zatem poznanie mechanizmów obrony komórek drożdży przed stresami ma też ważny aspekt praktyczny.
Mimo intensywnych badań nasza wiedza o mechanizmach odpowiedzi na stresy, w tym stresy środowiskowe, jest wciąż niepełna. Jedną z zagadek jest istnienie genów, których ekspresja w odpowiedzi na stresy ulega znacznemu podwyższeniu, ale których usunięcie ma pozornie nieznaczny wpływ na zdolność komórek do przetrwania stresu w warunkach laboratoryjnych. Funkcje takich genów przez dłuższy czas pozostawały nieustalone. Ich przykładem są białka S. cerevisiae należące do rodziny DJ-1/ThiJ/PfpI: Hsp31p, Hsp32p, Hsp33p i Hsp34p, których analizą funkcji zajmuje się nasz zespół.

2.
Jednym z endogennych źródeł stresu w komórce są reakcje chemiczne typu red-ox, których produktem ubocznym mogą być reaktywne formy tlenu. Takie reakcje zachodzą również w organellach komórkowych zwanych peroksysomami. Znajdują się w nich różne oksydazy produkujące nadtlenek wodoru (w drożdżach S. cerevisiae jest to oksydaza acylo-CoA) oraz katalazy, które go rozkładają. Biogeneza tych organelli, a w szczególności mechanizmy importu białek do ich wnętrza to drugie zagadnienie, które jest obiektem badań naszego zespołu. Obecnie dobrze poznane są dwie drogi importu białek do tych organelli, zależne od sygnałów PTS1 i PTS2 i odpowiednich białek receptorowych, Pex5p i Pex7p. Istnieją jednak białka (jednym z nich jest wspomniana wyżej oksydaza acylo-CoA), które są transportowane do wnętrza peroksysomów w sposób niezależny od ich, co wskazuje na istnienie jeszcze innych mechanizmów importu białek do tych organelli. Poznaniem jednego z nich, zależnego od hipotetycznego sygnału PTS3, zajmuje się nasz zespół.

3.
W naszej dyspozycji znajduje się także oprzyrządowanie do analiz całogenomowych przeprowadzanych techniką mikromacierzy. Składa się ono z czytnika do mikromacierzy Axon GenePix 4000B, pieca do hybrydyzacji firmy Agilent i odpowiedniego oprogramowania. Możliwe podejścia eksperymentalne obejmują miedzy innymi:
- analizę transkryptomu,
- analizę comparative genome hybridization (aCGH),
- testy populacyjne na kolekcji szczepów delecyjnych S. cerevisiae z wykorzystaniem mikromacierzy molekularnych kodów kreskowych.
Ale posiadany sprzęt umożliwia obrazowanie i analizę dowolnego eksperymentu, którego elementem jest odczyt fluorescencji barwników Cy3 i Cy5 (lub odpowiedników o podobnym widmie absorpcyjnym i emisyjnym) na szkiełku mikroskopowym o wymiarach 25x75 mm z rozdzielczością 5 μm.


Tematy w toku:

  • Określenie funkcji Hsp31p w komórkach S. cerevisiae: określenie jego lokalizacji wewnątrzkomórkowej oraz szczegółowa analiza systemów regulacyjnych odpowiedzi na stresy środowiskowe, jakim podlega promotor genu HSP31;
  • Analiza transkryptomu odpowiedzi komórek S. cerevisiae na stres wysokiego stężenia etanolu;
  • Identyfikacja reszt aminokwasowych składających się na sygnał PTS3, w białkach importowanych szlakiem zależnym od tego sygnału, takich jak oksydaza acylo-CoA i acetylotransferaza karnitynowa;
  • Poszukiwanie dalszych białek peroksysomalnych w drożdżach S. cerevisiae i w innych organizmach, które są importowane drogą zależna od PTS3.


Projekty badawcze:

  • 2013-2016 Badania nad topogenezą białek PTS3: nowa droga importu białek do peroksysomów.
  • 2011-2015 Funkcja i lokalizacja wewnątrzkomórkowa Hsp31p - białka odpowiedzi na stres z komórek Saccharomyces cerevisiae; implikacje funkcjonalne dla jego ortologa z Candida albicans.

 

 

Wybrane publikacje:

  1. Natkańska U, Skoneczna A, Skoneczny M.
    Oxidative stress triggers aggregation of GFP-tagged Hsp31p, the budding yeast environmental stress response chaperone, and glyoxalase III.
    Cell Stress Chaperones. 2017 Dec 20. doi: 10.1007/s12192-017-0868-8. [Epub ahead of print]
  2. Jończyk M, Sobkowiak A, Trzcinska-Danielewicz J, Skoneczny M, Solecka D, Fronk J, Sowiński P.
    Global analysis of gene expression in maize leaves treated with low temperature. II. Combined effect of severe cold
    (8 °C) and circadian rhythm.
    Plant Mol Biol. 2017 Oct;95(3):279-302.
  3. Krol K, Jendrysek J, Debski J, Skoneczny M, Kurlandzka A, Kaminska J, Dadlez M, Skoneczna A.
    Ribosomal DNA status inferred from DNA cloud assays and mass spectrometry identification of agarose-squeezed proteins interacting with chromatin (ASPIC-MS).
    Oncotarget. 2017 Apr 11;8(15):24988-25004.
  4. Natkańska U, Skoneczna A, Sieńko M, Skoneczny M.
    The budding yeast orthologue of Parkinson's disease-associated DJ-1 is a multi-stress response protein protecting cells against toxic glycolytic products.
    Biochim Biophys Acta. 2017 Jan;1864(1):39-50.
  5. Dabrowska M, Skoneczny M, Zielinski Z, Rode W.
    Wnt signaling in regulation of biological functions of the nurse cell harboring Trichinella spp.
    Parasit Vectors. 2016 Sep 2;9(1):483.
  6. Adamczyk J, Deregowska A, Skoneczny M, Skoneczna A, Natkanska U, Kwiatkowska A, Rawska E, Potocki L, Kuna E, Panek A, Lewinska A, Wnuk M.
    Copy number variations of genes involved in stress responses reflect the redox state and DNA damage in brewing yeasts.
    Cell Stress Chaperones. 2016 Sep;21(5):849-64.
  7. Adamczyk J, Deregowska A, Skoneczny M, Skoneczna A, Kwiatkowska A, Potocki L, Rawska E, Pabian S, Kaplan J, Lewinska A, Wnuk M.
    Adaptive response to chronic mild ethanol stress involves ROS, sirtuins and changes in chromosome dosage in wine yeasts.
    Oncotarget. 2016 May 24;7(21):29958-76.
  8. Sobkowiak A, Jończyk M, Adamczyk J, Szczepanik J, Solecka D, Kuciara I, Hetmańczyk K, Trzcinska-Danielewicz J, Grzybowski M, Skoneczny M, Fronk J, Sowiński P. (2016)
    Molecular foundations of chilling-tolerance of modern maize.
    BMC Genomics. 17(1):125.
  9. Skoneczna A, Kaniak A, Skoneczny M. (2015)
    Genetic instability in budding and fission yeast-sources and mechanisms.
    FEMS Microbiol Rev.39(6): 917-67.
  10. Krol K, Brózda I, Skoneczny M, Bretner M, Skoneczna A. (2015)
    A genomic screen revealing the importance of vesicular trafficking pathways in genome maintenance and protection against genotoxic stress in diploid Saccharomyces cerevisiae cells.
    PLOS One. 10(3): e0120702.
  11. Deregowska A, Adamczyk J, Kwiatkowska A, Gurgul A, Skoneczny M, Skoneczna A, Szmatola T, Jasielczuk I, Magda M, Rawska E, Pabian S, Panek A, Kaplan J, Lewinska A, Wnuk M. (2015)
    Shifts in rDNA levels act as a genome buffer promoting chromosome homeostasis.
    Cell Cycle. 14(21): 3475-87
  12. Deregowska A, Skoneczny M, Adamczyk J, Kwiatkowska A, Rawska E, Skoneczna A, Lewinska A, Wnuk M. (2015)
    Genome-wide array- CGH analysis reveals YRF1 gene copy number variation that modulates genetic stability in distillery yeasts.
    Oncotarget. 6(31): 30650-63.
  13. Piłsyk S, Natorff R, Sieńko M, Skoneczny M, Paszewski A, Brzywczy J. (2015)
    The Aspergillus nidulans metZ gene encodes a transcription factor involved in regulation of sulfur metabolism in this fungus and other Eurotiales.
    Curr Genet. 61(2):115-25.
  14. Sieńko M, Natorff R, Skoneczny M, Kruszewska J, Paszewski A, Brzywczy J. (2014)
    Regulatory mutations affecting sulfur metabolism induce environmental stress response in Aspergillus nidulans.
    Fungal Genet Biol. 65:37-47.
  15. Moniuszko G, Skoneczny M, Zientara-Rytter K, Wawrzyńska A, Głów D, Cristescu SM, Harren FJ, Sirko A. (2013)
    Tobacco LSU-like protein couples sulphur-deficiency response with ethylene signalling pathway.
    J Exp Bot.64(16):5173-82.
  16. Cena A, Skoneczny M, Chełstowska A, Kowalec P, Natorff R, Kurlandzka A. (2013)
    Cohesin Irr1/Scc3 is likely to influence transcription in Saccharomyces cerevisiae via interaction with Mediator complex.
    Acta Biochim Pol.;60(2):233-8.
  17. Dabrowska M, Skoneczny M, Rode W. (2011)
    Functional gene expression profile underlying methotrexate-induced senescence in human colon cancer cells.
    Tumour Biol. 32(5):965-76.
  18. Alabrudzińska M, Skoneczny M, Skoneczna A. (2011)
    Diploid-specific genome stability genes of S. cerevisiae: Genomic screen reveals haploidization as an escape from persisting DNA rearrangement stress.
    PLOS One 6(6): e21124.
  19. Dabrowska M, Skoneczny M, Zielinski Z, Rode W. (2008)
    Nurse cell of Trichinella spp. as a model of long-term cell cycle arrest.
    Cell Cycle. 7(14):2167-78.
  20. Skoneczna A, McIntyre J, Skoneczny M, Policińska Z, Śledziewska-Gójska E. (2007)
    Polymerase eta is a short-lived, proteasomally degraded protein that is temporarily stabilized following UV irradiation in Saccharomyces cerevisiae.
    J. Mol. Biol. 366: 1074-1086.
  21. Skoneczna A, Miciałkiewicz A, Skoneczny M. (2007)
    Saccharomyces cerevisiae Hsp31p, a stress response protein conferring protection against reactive oxygen species.
    Free Radic. Biol. Med. 42: 1409-1420.